In nefropatologia per le indagini immunoistochimiche si possono usare tecniche di immunofluorescenza diretta su materiale fresco e criopreservato oppure tecniche di immunoperossidasi su materiale fissato e incluso in paraffina.  

Mentre le prime garantiscono una migliore definizione dei depositi immuni anche nella loro valutazione quantitativa in base all’intensità di fluorescenza e un’alta sensibilità con scarso background fluorescente, le seconde garantiscono sezioni permanenti con maggior dettaglio morfologico ma sono gravate da un elevato background e non sempre evidenziano le frazioni del complemento e la restrizione monotipica delle catene leggere.

Pertanto è altamente preferibile l’adozione delle tecniche di immunofluorescenza su materiale fresco criopreservato.

Si sottolinea anche la possibilità di eseguire tecniche di immunofluorescenza su materiale fissato e incluso in paraffina (i risultati peraltro non sono comparabili con quelli ottenuti sul materiale congelato).

In considerazione del decadimento della fluorescenza sarebbe inoltre auspicabile:  

1. l’ acquisizione fotografica dei reperti con archiviazione digitale delle immagini o in alternativa la conservazione dei vetrini positivi  a -80°C
2. la conservazione del materiale residuo e di eventuali sezioni non colorate a -80°C per rendere ripetibile l’indagine

FASI DL PROCESSO

L’immunofluorescenza su materiale criopreservato richiede le seguenti fasi di processo:

1. congelamento del frustolo
2. sezione al criostato
3. reazione di immunofluorescenza
4. lettura al microscopio in epifluorescenza

Tecniche di congelamento

Il congelamento deve avvenire immediatamente dopo la suddivisione del campione, utilizzando tecniche di raffreddamento rapido:

• inclusione del frammento in OCT
• immersione diretta di azoto liquido
• immersione in isopentano preraffreddato in azoto liquido

Sezioni al criostato

• Le sezioni seriate di 3-3,5 μm di spessore per almeno 3 livelli dovrebbero essere preferibilmente effettuate utilizzando un criostato dedicato.
• Prima della seriatura è necessario verificare la presenza di glomeruli sulla sezione criostatata con colorazione rapida (E&E o Blu di Toluidina).

Reazione di immunoistochimica

• Il pannello di base è rappresentato da: IgG, IgA, IgM, C1q, C3, Fibrinogeno, Kappa, Lambda.
• In casi selezionati è possibile anche una tipizzazione delle sottoclassi delle IgG: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
• C4d in patologia del trapianto.
• Altri anticorpi da utilizzare in casi selezionati: componenti dell’amiloide (A e P), fibronecti na, collagene III, anticorpi anti-catene alfa nell’Alport.